1. 細(xì)胞難脫離

 

• 培養(yǎng)基內(nèi)含有某些抑制成分（例如血清）使細(xì)胞解離液失活。

 

解決對(duì)策：在加入細(xì)胞解離液（dissociating solution）之前，先用DPBS潤洗細(xì)胞兩次或者是直接用細(xì)胞解離液潤洗細(xì)胞。

 

• 選用的細(xì)胞解離液太弱。

 

解決對(duì)策：提高酶濃度、EDTA濃度，或者使用作用更強(qiáng)的細(xì)胞解離液（如dispase, collagenase），或者是把細(xì)胞置于37°C孵育以提高解離液的活性。

 

• 細(xì)胞達(dá)到100%匯合時(shí)間太久，細(xì)胞間連接變得非常牢固，阻礙了解離液滲透到細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸的界面。

 

解決對(duì)策：當(dāng)細(xì)胞達(dá)到大約70%-90%匯合時(shí)，即進(jìn)行傳代。

 

2. 細(xì)胞脫離下來后聚集成團(tuán)（Clumps）

 

• 分離過程太劇烈，導(dǎo)致細(xì)胞裂解釋放基因組DNA。原因有二：一，移液槍吹打太劇烈；第二，選用的細(xì)胞解離液太強(qiáng)或有毒性，導(dǎo)致pH或滲透壓異常。

 

解決對(duì)策：往細(xì)胞懸液內(nèi)加入一滴無菌DNAse (1 mg/ml in water)使DNA鏈斷裂。在隨后的操作中，注意溫和吹打細(xì)胞懸液，縮短孵育時(shí)間，換用弱一點(diǎn)的細(xì)胞解離液或者在低一點(diǎn)的溫度下孵育。

 

• 如果收集的單細(xì)胞懸液沒有立即加入培養(yǎng)基稀釋并接種到新的培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，而是在室溫放置一段時(shí)間。這種情況下，細(xì)胞也有可能會(huì)聚集成團(tuán)。

 

解決對(duì)策：將細(xì)胞懸液放置在冰上。

 

• 細(xì)胞懸液離心去除多余解離液時(shí)，離心太劇烈或時(shí)間過久。

 

解決對(duì)策：確保溫和離心，推薦使用125g離心10 min。

 

3. 細(xì)胞重新貼壁困難

 

• 細(xì)胞解離過程持續(xù)時(shí)間過長，使得存在于細(xì)胞膜上的細(xì)胞附著所必需的蛋白剝離。

 

• 培養(yǎng)基內(nèi)缺少足夠的血清或黏附因子（常見于無血清培養(yǎng)基）。

 

解決對(duì)策：往培養(yǎng)基內(nèi)添加黏附因子或者選用蛋白（collagen, poly-L-lysine, fibronectin, gelatin, etc.）包被過的培養(yǎng)容器。

 

• 未失活細(xì)胞解離液或者離心去除細(xì)胞解離液。

 

解決對(duì)策：在培養(yǎng)基內(nèi)添加額外的血清或特異性酶抑制劑（例如，大豆胰蛋白酶抑制劑）中和細(xì)胞解離液。亦或使用125g離心5min去除細(xì)胞解離液，然后使用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

 

4. 細(xì)胞活力低

 

• 細(xì)胞分離過程太劇烈

 

解決對(duì)策：自行摸索解離時(shí)間。

 

• 配制細(xì)胞分離液所用的平衡鹽溶液（Balanced Salt Solution）pH或滲透壓異常。

 

解決對(duì)策：測量pH或滲透壓或直接換一瓶新的平衡鹽溶液。

 

• 在重新接種之前，單細(xì)胞懸液以非常高的細(xì)胞密度在室溫放置時(shí)間過長。

 

解決對(duì)策：將細(xì)胞懸液置于冰上。

 

• 培養(yǎng)基選擇不恰當(dāng)。

 

解決對(duì)策：推薦使用與原代細(xì)胞相配套的專屬培養(yǎng)基。